Die real time PCR hat sich als Standard-Methode für den Nachweis und die Quantifizierung von DNA und RNA etabliert. Am ersten Tag erlernen Sie die Grundlagen der real time PCR. Dabei werden unter anderem unterschiedliche DNA- und RNA-Präparationsmethoden vorgestellt. Im praktischen Teil werden Sie mittels SYBRGreen und einer Detektionssonde die Menge Legionellen in einer Probe bestimmen. Im zweiten Teil des Kurses werden die theoretischen Grundlagen der real time PCR mit den unterschiedlichen Detektionsformaten und Geräteplattformen und deren Vor- und Nachteile erklärt. Primer-Design und die Auswahl der richtigen Detektionssonden sind hier ein zentrales Thema. Im letzten Kursteil werden Experimente zur absoluten Quantifizierung besprochen und verschiedene Auswertemöglichkeiten demonstriert.

Im theoretischen Teil werden u.a. folgende Themen behandelt:

• Grundlagen des biochemischen Aufbaus und der Struktur von DNA und RNA
• Einführung in die biochemischen und technischen Grundlagen der quantitativen Realtime-PCR
• Aufbau und Komplexität von Genomen
• Unterschiedliche Detektionsformate
• Absolute und relative Quantifizierung mittels Realtime-PCR
• Detektions- und Referenzfarbstoffe
• Verschiedene Geräteplattformen und deren Vor- und Nachteile
• Primerdesign und die Auswahl der Detektionssonden
• Sondenbibliotheken und kommerziell verfügbare Assays
• Schmelzkurvenanalyse
• Standardkurven und endogene Kontrollen
• Darstellung und Aufbereitung der experimentellen Daten
• Trouble shooting und Diskussion Ihrer Anwendungen
• Maßnahmenkatalog zur Vermeidung und Lösung häufig auftretenter Probleme
• Sondenbibliotheken und kommerziell verfügbare Assays
• Optimierte Vorbereitung und Durchführung komplexer Realtime-PCR-Experimente
• Schmelzkurvenanalyse
• Standardkurven und endogene Kontrollen
• Darstellung und Aufbereitung der experimentellen Daten
• statistische Modelle zur Auswertung der experimentellen Daten
• Maßnahmenkatalog zur Vermeidung und Lösung häufig auftretender Probleme

Der Praxisteil umfasst:

• Nachweis und Quantifizierung von Legionellen mittels SYBR-Green
• Quantifizierung von Legionellen mittels Standardkurve und Detektionssonden
• Präparation von RNA und Synthese von cDNA
• Relative Quantifizierung in einer Genexpressionsstudie
• Analyse der Schmelzkurve
• Verschiedene Auswertungsmethoden

Neben einem umfassenden Überblick über verschiedene Realtime-PCR-Techniken und deren spezifischen Eigenschaften werden bei umfangreichen praktischen Experimenten alle für die verschiedenen Realtime-PCR-Analysen erforderlichen Schritte durchgeführt und dabei gezeigt, wie den Herausfroderungen dieser Methode begegnet und die Leistungsfähigkeit dieser Methode professionell genutzt.

Technische und wissenschaftliche Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter mit Grundkenntnissen in der Molekularbiologie. PCR Kenntnisse sind nicht erforderlich.

Dr. Johannes Becker-Follmann studierte Biologie und Philosophie in  Saarbrücken und Freiburg. Er promovierte am Institut für Humangenetik  und Anthropologie über “Vergleichende Genkartierungen bei Mensch  und Maus“. Nach Forschungsaufenthalten in Osaka/Japan, Freiburg und  Berlin gründete er im Frühjahr 2000 das Institut für Polymorphismus und  Mutationsanalytik Deutschland in Homburg/Saar, das sich hauptsächlich  mit der Analyse von DNA verschiedener Spezies beschäftigt. Seit 2002 führt er Schwerpunktseminare und Workshops zu PCR-Themen durch.