PCR, Real Time PCR und Multiplex-PCR laufen nicht immer zufriedenstellend, sei es dass die Nachweisgrenze zu gering ist, Inhibitoren auftreten, Primer nicht miteinander funktionieren oder einfach Kosten- und Zeitaufwand optimiert werden sollten.
Im Grunde besteht eine PCR-Analyse aus drei Verfahren mit eigenen Qualitätskontrollen: Template-Präparation, das eigentliche PCR und die anschließende PCR-Analytik.
Zum Thema Template-Präparation geben wir einen Überblick über die Vor- und Nachteile verschiedener Verfahren von single cell-Präparationen, quick and dirty, über schwierige Proben, reverse Transcription (cDNA-Synthese) bis zu genomischen DNA-Amplifikations-Kits. Zur PCR-Optimierung werden verschiedene Temperatur-Zeit-Profile und Reagenzien behandelt. In der PCR-Analytik geht es um die Kosten- und Zeitoptimierung, d.h. mit welchem Verfahren bekomme ich am schnellsten und kostengünstigsten ein zuverlässiges Ergebnis.
Auszug aus dem Kursprogramm
Im theoretischen Teil werden u.a. folgende Themen behandelt:
- Prinzip der PCR und Real Time PCR
- Komplexität unterschiedlicher Templates: Arabidopsis bis Zika-Virus
- Methoden der Template-Präparation im Überblick
- Ausgewählte Methoden: single cell DNA-Präparation, Nahrungsmittel, cDNA-Synthesen,
- genomische Amplifikation
- PCR: Temperatur-Zeit-Profile, Annealing-Temperatur, Magnesium und Primer-Titration
- Multiplex-PCR: Puffer und Additive, Primer- und Sonden-Kontrolle, OD-Messung, in-silico
- PCR, BLAST, Oligoanalyzer
- PCR-Analytik: wir diskutieren und vergleichen verschiedene Verfahren zum Nachweis von
- DNA-Fragmenten, zur Genotypisierung und zur Sequenzierung
Der Praxisteil umfasst:
- Real Time PCR mit unterschiedlichen DNA-Präparationen: Probleme erkennen
- Effizienz- und Inhibitions-Bestimmung
- Titration der Primer für ein Multiplex
- Optimierung mittels Magnesium und verschiedenen Annealing-Temperaturen
- Design of Experiment: Taguchi gegen Kombinatorik
Zielgruppe
Technische und wissenschaftliche Mitarbeiter/-innen, die bereits über PCR-Erfahrungen verfügen.
Dozent
Dr. Johannes Becker-Follmann studierte Biologie und Philosophie in Saarbrücken und Freiburg. Er promovierte am Institut für Humangenetik und Anthropologie in Freiburg über “Vergleichende Genkartierungen bei Mensch und Maus“. Nach Forschungsaufenthalten in Osaka/Japan, Freiburg und Berlin gründete er im Jahr 2000 das Institut für Polymorphismus und Mutationsanalytik in Saarbrücken. Seit 2017 ist er Leiter des Forschungs- und Entwicklungslabors der Eluthia GmbH und entwickelt Tests für die post- und pränatale Diagnostik. Seit 2002 führt er Seminare und Workshops zu PCR-Themen durch.