RNA Isolation mit einfachen Protokoll

RNA-Isolation - RNA-Extraction - RNA-Aufreinigung

Die RNA-Isolierung ist eine Basismethode unter anderem zur Analyse der Genexpression (mRNA) und somit auch eine Analyse der aktuellen Zelltätigkeit (zum Beispiel als Reaktion der Zelle auf einen Trigger, eine Aktivierung, eine Inhibition oder eine sonstige Einflußnahme auf das Stoffwechselgeschehen).

Achtung: Seit kurzem unterliegen alle Nukleinsäure-Isolations Kits beim Transport der neuen Gefahrgutverordnung . Trotz eines stark erhöhten Verwaltungsaufwandes und gestiegenen Transportkosten bleiben auch für diese Kits die geringen Transportkosten von Bio&SELL stabil!  Sie haben Diese E-Mail-Adresse ist vor Spambots geschützt! Zur Anzeige muss JavaScript eingeschaltet sein!

 

Methoden der RNA-Aufreinigung

Man unterscheidet zwei grundlegende Methoden der RNA-Extraktion:

Die modifizierte Guanidiniumthiocyanat Methode nach Piotr Chomczynski und Nicoletta Sacchi
(Bio&SELL Tri-Flüssig)

(Weitere Informationen hierzu: PMID 2440339 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2440339/)
Quellenangabe: Anal Biochem. 1987 Apr;162(1):156-9. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)

Die Adsorption- oder Säulchen-Methode
(Bio&SELL RNA-Minikit)


Die Säulchenmethode unterscheidet wiederum zwischen verschiedenen Protokollen:

 Alle Protokolle auf Deutsch und in Englisch erhältlich.

 

RNA Isolation und RNasen

Prinzipiell gilt für alle RNA-Typen,

  • mRNA (messanger RNA)
  • rRNA (ribosomale RNA)
  • siRNA (small interfering RNA)
  • tRNA (tranfer RNA)

dass sie sowohl deutlich instabiler sind als DNA-Moleküle und gegenüber RNasen äußerst empfindlich sind und so einer der ersten, grundlegenden Schritte jeder RNA-Isolation dieDiese E-Mail-Adresse ist vor Spambots geschützt! Zur Anzeige muss JavaScript eingeschaltet sein! (Endoribonukleasen RNase A, RNase H, RNase P und Exoribonukleasen RNase R RNase D) oder die Trennung der RNA-Moleküle von den RNasen sein sollte.

Zur Auflockerung

Für die richtige Schreibweise denken Sie an die (Schnupfen-)Nasen: RNase.
Die Schreibweise RNAse gilt als nicht korrekt.

 

Arbeitsverhalten bei RNA-Aufreinigung

Tragen Sie grundsätzlich Latex- oder Vinylhandschuhe bei der RNA-Isolation und vermeiden Sie den Kontak zu potentiellen exogenen RNasen (auch im Schweiß an Ihrer Hautoverläche befinden RNasen). Sie können bei Diese E-Mail-Adresse ist vor Spambots geschützt! Zur Anzeige muss JavaScript eingeschaltet sein! beziehen, welches Sie grundsätzlich bei Ihren Versuche und Ihrer Arbeit mit RNA-Molekülen verwenden sollten.
Eine genauere Auflistung der Vorsichtsmaßnahmen zur Kontamination mit RNAsen finden Sie im Bio&SELL Protokoll zur RNA-Isolation.

 


RNA-Isolierung - RNA Integrität und Gelelektrophorese

Hier wird ein Agarosegel verwendet, das mit verschiedenen Gel-Farbstoffen (z.B. Bio&SELL GreenGeL DNA/RNA Stain oder Bio&SELL RedGeL DNA/RNA Stain oder Methylenblau ) angefärbt wird. Ist die RNA im Gel intakt so erkennt man zwei deutlich getrennte Banden, nämlich die 18S- und 28S-Bande ribosomaler RNA. Das 1:2-Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten der 18S- und 28S-rRNA-Banden zeigt, dass die mRNA undegradiert ist. Die 5S-Bande ist in den meisten Gelen nicht nicht sichtbar.

 

Reinheit der RNA nach der RNA-Extraction

Mit der Spektralphotometrie wird die optische Dichte bei λ=260nm (OD260) gemessen (Absorptionsmaximum von Nukleinsäuren (DNA, RNA).
Ebenso bei λ=280nm (OD280) (Absorptionsmaximum von Proteinen). Eine Proteinkontamination der RNA-Isolierung mit Proteinen zeigt der Quotient der Spektralmessung aus OD260 und OD280. Reine RNA zeigt einen Quotienten von 2,0.
Mit den Bio&SELL RNA-Aufreinigungs-Kits erreichen Sie diese werte bei einer herkömmlichen Probe fast immer.

 

Mengen- und Konzentrationsbestimmung nach der RNA-Isolation


Eine OD von 1 bei 260 nm sind
doppelsträngige DNA: 50 µg/ml
einzelsträngige DNA: 40 µg/ml
einzelsträngige RNA: 33 µg/ml

Wenn eine OD260 = 1, 40 µg/ml RNA entspricht,so lautet die Formel zur Bestimmung der RNA-Konzentration:
Konzentration [µg/ml] = OD260 × 40 µg/ml × Verdünnungsfaktor

 

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