Hygromycin B ist ein besonderes Aminoglycosid-Antibiotikum, dastoxisch auf prokayrotische und eukaryotische Zellen wirkt. Es blockiert die Proteinsynthese von Bakterien, Pilzen und höheren eukaryotischen Zellen durch Abbruch der Translokation, was in Lesefehlern der Polymerasen und Kettenabbrüchen resultiert. In der Zellkultur dient Hygromycin B als Selektionsantibiotikum für transformierte Zellen, die mit Hygromycin B-Resistenzgenen (hyp oder hph) transfiziert wurden. Da Hygromycin B eine andere antibiotische Wirkungsweise besitzt als G418 können beide Selektionsantibiotika auch ideal in Kombination verwendet werden.