Taq Polymerase

PCR-Troubleshooting?

Ganz einfach mit der S-Solution von Bio&SELL. Die PCR-Ergebnisse ausgehend von Templates mit hohem GC-Gehalt können durch Zugabe der S-Solution erheblich verbessert werden. Auch bei unerwünschten Nebenprodukten in der PCR-Reaktion kann die S-Solution zur Hintergrund-minimierung beitragen.

Die bei der Bio&SELL Taq DNA Polymerase separat gelieferte MgCl₂-Lösung erlaubt die Variation der Mg²⁺-Ionen-Konzentration in Ihrem PCR-Ansatz und liefert dadurch weiteren Optimierungsspielraum für die jeweiligen, spezifischen PCR-Reaktionen. In der Lehre können Sie hier Ihren Studenten die Mg²⁺-Abhängigkeit der Enzymaktivität der DNA-Polymerase eindrucksvoll demonstrieren.

Assoziierte Produkte

PFU-Polymerase - Hot-Start-Taq-Polymerase
PCR-Master-Mixe - Hot-Start-Taq Master-Mixe
dNTP-Mix - dNTP Set
Universal-Agarose (Standard-Agarose) - Low-melt Agarose
Lab-Cycler (Thermo-Cycler)

Taq Polymerasen und PCR-Optimierung

Die Taq-DNA-Polymerase oder kurz Taq-Polymerase wurde ursprünglich aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus isoliert. Diese DNA-Polymerase findet ihre Anwendung bei der Durchführung von PCR-Reaktionen (engl: polymerase chain reaction) in jedem molekularbiologisch arbeitendem Labor. Die Bio&SELL Taq-Polymerase wird rekombinant in E.coli exprimiert. Der entscheidende Vorteil der Taq-Polymerase ist ihre Stabilität bei hohen Temperaturen, die im Denaturierungsschritt bis zu 35 mal je nach Zykluszahl des jeweiligen PCR-Programms erreicht werden müssen. Die Bio&SELL Taq Polymerase ist eine hochprozessive 5’ -> 3’-DNA-Polymerase mit 5’ -> 3’-Exonukleaseaktivität. Eine 3’ -> 5’-Exonukleaseaktivität fehlt vollständig. Wie jede DNA-Polymerase ist die Enzymaktivität von einer ausreichende hohen Mg²⁺-Ionen-Konzentration abhänging. Die Konzentration kann variiert werden und so die optimale Leistungfähigkeit der Taq-Polymerase erreicht werden. Zusätzlich fügt das Enzym einzelne Nukleotide (fast ausschließlich Adenosin) an die 3´-Enden der DNAs an, so dass eine TA-Klonierung ohne weitere Modifizierungen möglich ist.

Im ersten Schritt einer PCR-Reaktion muß die DNA, die als Vorlage dient (engl: template), denaturiert werden. Das heißt doppelsträngige DNA wird in die Einzelstränge zerlegt und etwaige gebildete Sekundärstrukturen werden aufgeschmolzen. Im zweiten Schritt muß die sequenzspezifische Anlagerung der Primer (in der Anwendung meist als Oligos, von Oligonukleotiden, bezeichnet) an die template DNA erfolgen (engl. annealing). Dazu muss die exakte, Primer-spezifische Annealing-Temperatur in der Probe erreicht werden. Maßgeblich für den Erfolg einer PCR-Reaktion ist die Wahl der korrekten Annealing-Temperatur. Ist die Temperatur zu hoch gewählt, ist die Ausbeute an Produkt nicht optimal. Bei einer zu niedrig gewählten Annealing-Temperatur können unspezifische Anlagerung der Primer zu unerwünschten Nebenprodukten führen. Die optimale Annealing-Temperatur ist abhängig von der Schmelztemperatur der Primer. Bereits beim Primerdesign der forward- und reverse-Primer sollten die Schmelztemperaturen berücksichtigt werden, da diese aufeinander abgestimmt sein müssen. Ein weiterer kritischer Punkt ist die Bildung von Sekundärstrukturen innerhalb der einzelnen Primer-Moleküle oder Primer-Dimeren-Bildung.

Essentiell ist die Qualität des verwendeten Thermocyclers, in dem die PCR-Reaktion durchgeführt wird. Neben schnellen Heiz-und Kühlraten und einer absolut präzisen Regeltechnik ist eine benutzerfreundliche Bedienoberfläche essentiell. Mit dem Labcycler gradient von Bio&SELL kann effizient und schnell in nur einer Versuchsreihe die optimale Annealing-Temperatur bestimmt werden. Durch Programmierung eines Temperatur-Gradienten in beliebiger Abstufung im Annealing-Schritt können mehrere Annealing-Temperaturen gleichzeitig verglichen werden.

Im dritten Schritt der PCR-Reaktion, der Elongationsphase, wird das Temperaturoptimum der jeweils eingesetzten Taq DNA Polymerase gewählt. Die DNA-Polymerase muß für die jeweilige Anwendung gewählt werden. Ist eine absolute Sequenzgenauigkeit gefordert, empfiehlt sich der Einsatz der Bio&SELL Pfu Polymerase. Der Unterschied zur normalen Taq-DNA-Polymerase liegt in der „Proof reading“ Funktion. Durch die 3'-5'-Exonuklease-Aktivität werden falsch eingebaute Nukleotide entfernt. Neben der Taq-Polymerase kommen auch sogenannte Hot-Start-Taq-Polymerasen zum Einsatz. Eine Hot-Start-Taq-Polymerase zeichnet sich dadurch aus, dass sie ihre Aktivität erst nach einer mehrminütigen Inkubation bei 95°C entfaltet. Dies verhindert die Amplifikation von unerwünschten Nebenprodukten. Die Bio&SELL Hot Start Taq Polymerase bietet zusätzlich zwei Puffersysteme und eine S-Solution für GC-reiche Templates.

Anwendungs- und Qualitätskontrolle

• Primer-Extensionsreaktionen: das Enzym ist frei von Nicking- und Primeraktivitäten sowie von Exonukleasen und unspezifischen Endonukleasen.
• SDS/PAGE: 95 kD-Bande, Reinheit >k98 %.
• Aktivität und Stabilität wurden mittels PCR getestet.
• Die Fehlerrate pro Nukeotid pro Zyklus ist 8.3x10^-5, die Genauigkeit 1.2x10⁴.
• Die Halbwertzeit beträgt bei 95°C 90 Min.

Lager- und Verdünnungspuffer

50% Glyzerol (v/v), 20 mM Tris ·HCI (ph 8,7 bei 25 °C), 100 mM kCI, 0,1 mM EDTA und Stabilisatoren.

Unitdefinition

Ein Unit ist die Enzymmenge, die benötigt wird, um 10 nmol dNTP in 30 Min. bei 74 °C in eine säureunlösliche Form umzuwandeln.