qPCR Mastermix Probe Rox
qPCR Mastermix EvaGreen® Rox ist ein speziell optimierter Mastermix für Sonden-basierte Real-Time PCRs (quantitative Polymerase Chain Reactions). Er enthält alle notwendigen Komponenten für eine qPCR außer Template-DNA Primer und Sonde ("Probe"). Der 5x konzentrierte Kit ist ideal für eine schnelle und zuverlässige Detektion/Quantifizierung von DNA- und cDNA-Targets und enthält optimierte Komponenten sowie Hot-Start Taq DNA-Polymerase, was auch die Detektion von "Low-Copy" DNA-Targets erlaubt
Dieses Kit enthält den Referenzfarbstoff Rox. Rox ist ein passiver, interner Referenzfarbstoff, der zur Normalisierung des Fluoreszenz-Reportersignals während der qPCR verwendet wird.
Eigenschaften
- 5x konzentrierter, ready-to-use Mastermix
- Thermostabile Hot-Start Taq DNA-Polymerase (Bis zu einem Monat bei Raumtemperatur stabil!)
- 12.5 mM MgCl2 (= 2.5 mM in 1x Lösung)
- Nukleotide (dATP, dGTP, dCCT, dTTP) in optimierter Zusammensetzung
- ROX-Referenzfarbstoff
Gut zu wissen
Wie funktioniert die Sonden-basierte qPCR-Detektion?
Bei der Sonden-basierten Real-Time PCR (z. B. mit TaqMan-Sonde) erfolgt die Detektion über eine sequenzspezifische Fluoreszenz-Sonde, die zusätzlich zu den Primern an die Ziel-DNA bindet. Die Sonde trägt einen Reporter-Farbstoff am 5’-Ende und einen Quencher am 3’-Ende. Der Quencher unterdrückt die Fluoreszenz des Reporters, solange sich beide in räumlicher Nähe zueinander befinden. Während der Elongationsphase baut die DNA-Polymerase die gebundene Sonde aufgrund ihrer 5’→3’-Exonuklease-Aktivität ab. Dadurch werden Reporter und Quencher voneinander getrennt und der Reporter emittiert Fluoreszenz (siehe Abbildung). Mit jeder weiteren DNA-Amplifikation nimmt die Fluoreszenz also proportional zu. Das Signal wird in Echtzeit gemessen und erlaubt eine die quantitative Bestimmung der Ziel-DNA.
Welche Taq DNA-Polymerase wird im Mastermix verwendet?
Die enthaltene Hot-Start Taq DNA-Polymerase ist eine Weiterentwicklung unserer thermostabilen Taq DNA-Polymerase (isoliert aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus). Durch eine eingeführte Modifikation wird die Enzymaktivität unserer Hot-Start Taq DNA-Polymerase erst durch eine einmalige Inkubation bei 95°C für 15 min freigesetzt.
Unsere Hot-Start Taq DNA-Polymerase ist eine hochprozessive 5’ - 3’-DNA-Polymerase mit 5’ - 3’-Exonukleaseaktivität. Eine 3’ - 5’-Exonukleaseaktivität fehlt vollständig. Zusätzlich fügt das Enzym einzelne Nukleotide (fast ausschließlich Adenosin) an die 3´-Enden der DNAs an, so dass eine TA-Klonierung ohne weitere Modifizierungen möglich ist.